目前法医实验室用于基因组DNA定量最普遍的方法就是所谓的“斑点杂交”法。此方法对人类和其他灵长类DNA具有特异性,因为它的一段40bp的探针与灵长类特异的仅卫星DNA序列D1721互补,此序列位于17号染色体。斑点杂交法早期使用放射性探针,经修改和商业化后使用化学发光或比色检测技术。
斑点杂交法首先是将基因组DNA点在尼龙膜上,然后加入人类特异性探针,比较样品和一系列标准品的信号强度。斑点杂交是相对定量法,将已知浓度的样品DNA进行梯度稀释后得到一系列标准品,未知样品与标准品比较得出未知样品的浓度。由于斑点杂交膜上的未知样品与标准品比对是用肉跟来辨别的,所以易受分析者的主观影响。采用CCD照相图像系统的数码抓捕和斑点杂交图像定量可以改善其分析过程。
通常,一张斑点杂交膜上可同时检测30个样品,待测样品两侧分别加6—8个标准品用来比对。如20ng、10ng、5ng、2.5ng等。一般用于此定量实验的DNA模板量是5ul。
此项检测要耗费几个小时来完成,但相当灵敏,因为它可检测单链和双链DNA,其检测量低至约150pg或50个拷贝的人类基因组DNA。150pg标准DNA的X线胶片感光核检测只需15分钟。对于化学发光检测法,通过延长X线胶片曝光时间和在膜上点更稀浓度的DNA标准品,可将灵敏度提高到150pg以下。有报道通过长达3个小时的曝光可检测到10~20pg水平。一些法医工作者甚至杂交检测看不到结果时,继续进行DNA分析,还经常能获得成功的STR分型。所以,斑点杂交定量并不像期望的那样灵敏。
在2004年初,ABI公司推出了商品化斑点杂交定量产品,称为Quant-iBlot人类DNA定量试剂盒。这个试剂盒用17号染色体上的一段DNA探针检测样本中人类DNA浓度的水平。应切记此项技术虽是“人类特异性”检验,但对黑猩猩和大猩猩之类的灵长类动物也呈阳性,因人类和其余灵长类动物DNA序列存在相似性。
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